抽象的な
ヨトウムシ、Spodoptera fragiperda はトウモロコシの最も重要な害虫の 1 つであり、新たに中国に侵入しました。 S.frugiperdaの幼虫上のAutographa californica多核多面体ウイルス(AcMNPV),S.frugiperdaに対するAcMNPVの殺虫活性および生物防除効果を生物検定および野外有効性試験の方法によって研究および分析した。結果は、致死濃度中央値(LC)を示した。50)2に作用するAcMNPVのndS.Frugiperda の 1 齢幼虫は 2.9 倍でした 107PIB/mL。10の平均防除効果7PIB/mL AcMNPV+Bt懸濁液(1500mL/hm)2) S.frugiperda では 10 日間で 68.99% でした番目日は66.87%、15日は66.87%番目最後に,DNAMAN 6.0ソフトウェアを使用して死んだ昆虫のDNA相同性を同定し,その結果,死んだ昆虫とS.Frugiperdaのpolh,lef-8およびlef-9遺伝子配列配列が100であることが示された。上記の結果はすべて、AcMNPV が S.frugiperda の制御に重要な役割を果たしている可能性があることをさらに検証することができました。107PIB/mL AcMNPV＋BT 懸濁液（1500mL/hm）2）S.frugiperdaの若い幼虫の発生のピーク時と、高温と光の影響を避けるために晴れた日の午後4時から5時以降に適用する必要があり、ウイルスの準備がより効果的に行われます。 S.frugiperda に対する防除効果を向上させます。
キーワード: AcMNPV;ヨトウガ・フルギペルダ。鱗翅目害虫。幼虫。生物農薬;AcMNPV＋Btサスペンション;殺虫活性;グリーンの予防と管理
ヨトウガヨトウは、2019年に初めてミャンマーから中国に侵入した雑食性の渡り性害虫で、中国の26省・直轄市の1,518地区に急速に広がり、中国の食糧安全保障に深刻な脅威を与えている。これまでのヨトウムシの防除戦略では、ヨトウムシの発生の制御は依然として化学殺虫剤の大量使用に依存しています。化学農薬の過剰使用は、害虫の抵抗性、再蔓延、環境残留物および汚染を容易に引き起こす可能性があります。一連の深刻な問題により、現代農業の持続可能な発展が大きく制限されています。そのため、生物学的防除方法または生物農薬の代替が使用されています。ヨトウムシを防除するための殺虫剤の使用はますます重要になり、注目が高まっています。
Autographa californica 多核多角体ウイルス AcMNPV は、アルギリア アルファルファの幼虫から単離された多粒子包埋核多角体病ウイルスです。ビートガ、キャベツガ、アルギリア アルギラ、カリプテラ テリストイドなどの 30 種類以上の鱗翅目害虫に交差感染することができます。 Btなどの殺虫剤と非対象害虫ウイルスを相乗剤として配合した混合タイプは、多くのヤガ科害虫に対して明らかな相乗効果を示し、殺虫スペクトルをさらに広げ、殺虫効果を向上させます。AcMNPVは、武漢ユニオアシス生物技術有限公司が開発した昆虫ウイルスの新しい生物農薬です。これは、アルジリア アルファルファ核多角体病ウイルスと Bt 強力なウイルス相乗剤の組み合わせです。Aは優れた殺虫活性を有し、野菜、果樹、水田などに広く使用されています。本論文では,核多角体病ウイルスの広範な応用に対するデータ裏付けを提供するために,Spodoptera fragiperdaに対するAutographa californica多核多角体ウイルス(AcMNPV)の殺虫活性と生物防除効果を室内活性アッセイと野外実験によって検出し,評価した。トウモロコシにおけるヨトウガヨトウの生物学的防除。これは、ヨトウムシの防除における AcMNPV と Bt の懸濁剤の登録と適用に対する理論的基礎を提供します。
1.材料と方法
1.1ウイルスと生物剤をテストする
検査されたウイルスはAutographa californica多核多面体ウイルス（AcMNPV）でした。2019年5月20日、湖北省仙桃市のトウモロコシ畑からSpodoptera fragiperdaが採取され、武漢ユニオアシス生物技術社の研究室でウイルス感染スクリーニング検査が実施されました。 、株式会社（Autographa Californica 多核多面体ウイルス AcMNPV は、Spodoptera fragiperda に対して高い感染力を持っています。）、Spodoptera fragiperda の幼虫を飼育し、増殖させました。ウイルスに感染した死んだ幼虫を水で粉砕し、3 層のガーゼで濾過し、濾液を採取しました。 600r/min と 300r/min で遠心分離しました。マイクロカウントは 1.8 × 10 でした。101 mL あたりの毒性多角体（多面体包接体 PIB）、つまり純粋なテクニカル グレードの多角体病ウイルスを取得するため（1.8 x 1010PIB/mL)、低温で保存して保管します。
試験した生物学的因子は、Autographa california Nuclear Polyhedrosis.Bacillus thuringiensis、略して AcNPV.Bt (1.0 × 107 PIB/mL) でした。Wuhan Unioasis Bilogical Technology Co., LTD によって開発され、その子会社である Wuhan Chuqiang Biological Technology Co., LTD によって生産されます。
1.2試験昆虫
実験昆虫はヨトウガ（Spodoptera fragiperda）であった。2019年7月20日、湖北省通山県大長鎮鎮板橋村の夏トウモロコシ畑からヨトウガの幼虫が採取され、湖北省農業アカデミー植物保護土壌肥料研究所の研究室に持ち帰られた。サイエンス。新鮮で柔らかいトウモロコシの葉を、使い捨てのプラスチック製ペトリ皿（直径 8 cm、高さ 3 cm）に入れて 1 頭ずつ与えました。室内給餌条件は:(25±1)℃、相対湿度60%-70%、日長は16L:8Dであった。複数世代の繁殖の後、新鮮で滅菌された卵ブロックが使用のために保存されます。
1.3スポドプテラ・フルギペルダに対するAutographa californica多核多角体ウイルス(AcMNPV)の実験室活性
6つの濃度勾配、1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104まず、AcNPV の TC を 1.0 × 10 に希釈しました。9実験はブランク対照で処理しました。各プロセスを 3 回繰り返し、合計 7 つのプロセスを実行しました。
葉部分給餌法を採用した。すなわち、新鮮なトウモロコシの若葉（長さ2cm×幅2cm）を最初にウイルス懸濁液スプレーで処理し、次に幼虫を給餌し、シャーレ内で単一の頭部を給餌した。給餌ストリップは、温度 (25±1)℃、位相対湿度 (60% ~ 70%)、日長 (16L:8D) でした。有毒なトウモロコシの葉を食べた後は、新鮮な無毒なトウモロコシの葉を追加する必要があります。ヨトウムシの 2 齢幼虫 48 匹を繰り返し処理した。参考文献パート 9{9-11} 、ガ科の細胞および宿主におけるウイルスの増殖の変化、ウイルスによる昆虫の死亡数および昆虫の死滅数の変化を考慮し、感染後 7 日および 10 日後に死亡した昆虫の総数を調査し、死亡率を計算し、LC50 を計算しました。
1.4AcMNPV.Bt 懸濁液 1,000 万個のヨトウムシ幼虫に対する防除効果に関する野外試験
圃場有効性試験は、湖北省通山県荘王鎮小園村の夏トウモロコシ畑で実施されました。試験区は全長1500m２、土壌タイプは石灰質土壌、pH値は6.8、有機物含有量は13.9％、肥沃度は中〜高です。トウモロコシは一年中植えられており、トウモロコシの品種はXiyu No.3です。7月13日、2020年、45%化成肥料 750kg//hm２元肥として施肥して播種します。2019年以降、この畑ではヨトウムシの発生が深刻になっています。
合計 1,000 万個の AcMNPV.BT 懸濁液 (1500mL/hm)2) および 15% エマメクチン安息香酸塩。Indocarb 懸濁液 (300mL/hm)2)、一般的に使用される殺虫剤とブランク対照を 3 回の処理で処理しました。各処理は 4 回繰り返され、合計 12 の実験区画があり、各区画は 100m の面積をカバーしました。2
2020年8月26日の午後（ヨトウガの幼虫が多発する時期）、夕方に1回農薬を散布します。Lebangブランドの3WBJ-16DZ多機能バックパック電気スプレーが使用され、使用圧力は0.40〜0.60MPa、オリフィス直径は1mm、流量は60〜85L/hです。農薬散布日は晴れ、気温は23～32℃です。申請後1日目、3日目、5日目、7日目、10日目、15日目にアンケートを実施します。調査中、各プロットから 10 個のランダムなサンプリング ポイントが採取され、各ポイントで 10 個の植物が継続的に調査され、合計 100 個の植物が調査されました。各トウモロコシ植物の生きている昆虫、死亡数、中毒、および天敵の数を記録しました。関連する計算式は次のとおりです。
害虫減少率＝（散布前の生き虫数－散布後の生き虫数）／散布前の生き虫数
予防防除効果＝（処理区における害虫の減少率－防除区における害虫の減少率）／（１００－管理区における害虫の減少率）×１００％
1.5ACMNPVの分子同定
1) ウイルスサンプルをテストします。室内活動測定用の ACMNPV 母液 (サンプル 1)、生物学的製剤 1,000 万 ACMNPV.Bt SC (サンプル 2)、野外有効性試験後のウイルス感染昆虫の死骸 (サンプル 3)、およびウイルスに感染したヨトウムシの第 2 世代幼虫を選択します。サンプル３（サンプル４）で採取した昆虫の死骸を試験ウイルスサンプルとして、1,000万個のACMNPV.Bt中のAcMNPVがヨトウムシ幼虫に対して殺菌活性を有するかどうかを検証した。
2) DNA 抽出。AcMNPV サンプル 1.0 mL を採取し、蒸留水 99.0 mL を加え、1 分間十分に振盪します。振とう後の懸濁液 300μL をとり、アルカリ分解溶液 100μL を加え、37℃の水浴で 30 分間放置します。200μLのTris・HCl緩衝液を加え、10000r/minで8分間遠心分離する。上清を遠心管に取り、Protease K 5μL と SDS 60μL を加え、65℃のウォーターバスで 2 時間静置し、取り出して室温まで冷却します。650μLのMix L Tris飽和フェノールをウェルに加え、10000 r/minで5分間遠心分離し、上清を新しい遠沈管に取ります。フェノールとクロロホルム（体積比 1:1）の混合液 650μL を加え、10000 r/min で 5 分間遠心分離し、上清を新しい遠沈管に移します。クロロホルムとイソアミルアルコールの混合液（体積比 24:1）を 650μL 加え、10000 r/min で 5 分間遠心し、最後に上清を新しい遠心管に取ります。分光光度計を使用して DNA 濃度を測定します。
3) PCR増幅。T3 スーパーミックス標準システムの使用: サンプル DNA 2 μL、前後用プライマー 0.5 μL、T3 スーパー ミックス 18 μL、および ddH2O7 μL。PCR増幅条件は95℃です。3分間の予備変性後、98℃で15秒、52℃で20秒、72℃で20秒、最後に72℃で5分のサイクルを計42回行います。
4) DNA アガロースゲル電気泳動。PCR増幅産物2μLと5kb DNAマーカーをアガロースゲルに入れ、180Vで20分間電気泳動します。電気泳動後、ゲルイメージングシステムで PCR 産物を観察します。
Polh 上流プライマー:
AGGTTTCCCAGTCACGGGCTGAG-GATCCTTT
Polh ダウンストリームプライマー:
GAGCGGATAATTTCACACTGGTGTGTG-CAAACTCCTT
Lef-8 上流プライマー:
AGGGTTTCCCAGTCCACGCACGGGAAAT-GAC
Lef-8 下流プライマー:
GAGCGGATAATTTCACATTGTACGGATCTTTCGGC
Lef-9 上流プライマー
AGGGTTTCCCAGTCACGAAACGGGTACGCGG
Lef-9 下流プライマー:
GAGCGGATAATTTCACATTGTCACCGTCAGTC
最後に、DNAMAN6.0 ソフトウェアを適用して、測定された polh、lef-8、および lef-9 配列を比較します。
1.6データの分析と処理
実験データは、IBM SPSS 22.0 データ統計分析ソフトウェアを使用して処理されました。
ウイルス殺虫活性測定実験では、各濃度で処理した昆虫の死亡数と生存数をカウントし、死亡率と調整死亡率を計算し、確率値に換算します。各処理の濃度は Ig 値に変換されます。毒性回帰式 (傾き ± SE) は、作業確率値と重み、および LC を通じて計算されます。50値とその 95% 信頼限界、そして最後にカイ 2 乗検定を実行します(2）。圃場防除効果実験では、各処理における生きた昆虫の数をカウントし、害虫の減少率を計算しました。制御効果はMicrosoft Excelの編集式を用いて計算した。分析にはダンカン法が使用され、治療間の有意差を比較するために一元配置分散分析が使用されました。
本文中のグラフはすべて Microsoft Excel ソフトウェアを使用して作成されました。
2.結果と分析
2.1AcMNPVのヨトウガヨトウ幼虫に対する殺虫活性
屋内活動テストの結果 (表 1) は、7 日間の治療後に LC が低下したことを示しています。50AcMNPV がヨトウガの 2 齢幼虫に作用するのは 4.1x10 です。7PIB/mLとLC90は 1.05 x 108PIB/mL。10日間の治療後、LCは50AcMNPV の 2 齢幼虫への作用は 2.9x107PIB/mLとLC907.8x10です7PIB/mL。LC50そしてLC907日間の処理後のヨトウムシの2齢幼虫に対するAcMNPVの作用は、いずれも10日よりも高く、7日目でAcMNPVがヨトウガヨトウ幼虫に対して良好な殺虫活性を示したことが示された。
2.2 AcMNPV の磁場制御効果。BtはSpodoptera fragiperdaの幼虫に作用します
野外有効性試験の結果では、1,000万AcMNPVであることが示されました。Bt SC (1500 mL/hm)2) は、spodoptera fragiperda の幼虫に対して比較的ゆっくりとした効果がありました。散布後1日目、3日目、5日目の平均防除効果はそれぞれ11.57%、16.23%、15.56%であった。散布後７日目の平均防除効果は２１．８８％に過ぎなかった。しかし、散布後１０日目には防除効果が６８．９９％に急上昇し、散布後１５日目の平均防除効果も６６．８７％となった。ただし、化学薬品と比較すると、エマメクチン安息香酸塩+インドックスエア コンディショニングガーブ 15% (300mL/hm)2）、ヨトウガの幼虫に優れた殺虫効果があり、昆虫の数を急速に減らすことができます。投薬後1日目、3日目、5日目、7日目の平均制御効果は、それぞれ91.39%、92.66%、90.71%、87.19%でした。しかし、10 日目の平均制御効果は減少し始め、67.63% にとどまり、15 日目の平均制御効果は 51.60% に減少しました。詳細については、表 2 を参照してください。
同時に、対照区における昆虫の減少率は、処理後1日目、3日目、5日目ではマイナスとなり、昆虫の数が増加していることもわかりました。治療後 7 日目に陽性になり始めました (昆虫の個体数が減少し始めました)。10日目と15日目の昆虫の平均減少率はそれぞれ38.25%と47.00%であり、これは、ヨトウガの幼虫の一部が土壌中で蛹化し始め、10～15日後に世代が重なったことと関連している可能性が高い。 。
要約すると、1,000 万 AcMNPV であることがわかります。Bt SC (1500 mL/hm)2）はヨトウガに対して一定の防除効果がありますが、効果は遅く、散布後10～15日程度で効果が現れます。
2.3 AcMNPV の効果。天敵に対するBT
フィールド実験中、1,000万AcMNPVの効果。クモ、テントウムシ、カブトムシなどのトウモロコシの害虫の天敵に対する Bt 懸濁液も調査されました。その結果、1,000万AcMNPVという結果が出ました。Bt 懸濁液は、クモ、テントウムシ、カブトムシなどの天敵に大きな被害を及ぼさず、100 株あたり平均 13.4 匹の天敵でした。しかし、化学薬品であるエマメクチン安息香酸塩 + インドックスエア コンディショニングガーブ 15% 懸濁液は、クモ、テントウムシ、カブトムシなどの天敵に重大な毒性作用を及ぼしました。処理後 1 日目には、トウモロコシ 100 株の平均天敵数はわずか 3.1 個でしたが、処理後 3 日目には、さまざまな種類の天敵が 5.2 個しか見つかりませんでした (図 1)。1000万AcMNPVであることがわかります。Bt懸濁液は害虫の天敵に対して優れた保護効果を示しますが、エマメクチン安息香酸塩+インドキサエアコンディショニングガーブ15％懸濁液は天敵に対して比較的大きなダメージを与えます。
2.4 AcMNPV の分子同定
異なる試験サンプルの PCR 増幅結果は、サンプル 1、2、3、および 4 の polh、lef-8、および lef-9 の増幅フラグメントが一貫しており、サイズが正しいことを示しました。polh、lef-8、lef-9 遺伝子の PCR 産物はそれぞれ 0.54、0.716、0.29 kb でした (図 2)。これは、AcMNPV がヨトウガの幼虫に対して殺虫活性を有することを証明しています。
最後に、DNAMAN 6.0 ソフトウェアを使用して、サンプル 1、2、3、および 4 の polh、lef-8、および le.f-9 の増幅断片の配列アライメントを実行しました (図 3)。結果は、サンプル 1、2、3、および 4 の polh、lef-8、および lef-9 の増幅配列間の類似性が 100% であることを示し、サンプル 1、2、3、および 4 がすべて、同じウイルスAcMNPV。
3. ディスカッション
AcMNPV は昆虫の桿状ウイルスで、摂食を通じて昆虫の体内に感染します。ウイルスは昆虫の体内で増殖して広がり、徐々に全身に感染し、最終的には死に至ります。この研究の結果は、AcMNPV がヨトウガヨトウの幼虫に対して良好な生物学的活性を有することを示しています。７日目と１０日目のＬＣはそれぞれ４．１×１０７ＰＩＢ／ｍ，２．９×１０７ＰＩＢ／ｍであり，野外で良好な防除効果を示した。1000万AcMNPV.Btの混合懸濁液（1500mL/hm）2）は、処理後10日目と15日目に良好な平均防除効果があり、それぞれ68.99％と66.87％に達し、天敵に対して安全でした。したがって、AcMNPV がヨトウガの生物学的防除においてより大きな役割を果たすことができるように、研究開発の速度を加速する必要があります。Wuhan Chuqiang Biotechnology Co., Ltd.が製造する 1,000 万個の AcMNPV.Bt 懸濁液は、AcMNPV と生物殺虫剤 Bacillus thuringiensis (Bt) の化合物であり、ウイルスの殺虫活性を大幅に向上させることができます。Bt は優れた微生物殺虫活性を備えた広域殺虫剤であるため、AcMNPV を Bt と組み合わせると、その毒性は単一製剤と比較して大幅に改善されるはずです。これにより、Bt の殺虫範囲が拡大するだけでなく、その毒性も強化され、単一の製剤を使用して複数の害虫を防除するという目標が達成されます。野菜、果樹、米などで１０００万 AcMNPV.Bt の停止を広く推進できる理由もここにある。したがって、1,000 万 AcMNPV.Bt をトウモロコシのヨトウガヨトウの緑の防除剤として促進することができます。
本研究では、圃場効力試験を実施した際、防除区の昆虫個体数が急激に減少した場合（15日目の昆虫減少率は47.00％に達した）、平均1,000万AcMNPV.Btの防除効果を確認した。懸濁液（1500mL/hm）2）は治療後15日目で66.87％となり、急速に上昇傾向を示しました。化学農薬15％メトキサゾール・インディフェンカーブSC（300mL/hm）の平均的な防除効果2）治療後15日目には51.60％に減少しました。1,000 万 AcMNPV.Bt 懸濁液 (1500 mL/hm) であることがわかりますが、2）は、10～15日目にヨトウガに対して一定の防除効果が得られますが、生物農薬の効果が遅いこと、ヨトウガの幼虫の寿命が短く世代が重複していることを考慮すると、調査回数を増やし、調査時間を延長することが推奨されます。生物農薬（特にウイルス製剤）の野外有効性試験を実施すると、より理想的な実験結果が得られる可能性があります。これはこの研究の限界でもあります。要約すると、化学薬剤は生物薬剤と比較して害虫に対する殺傷効果が比較的高く、効果が早く現れます。害虫の発生時の緊急予防および制御手段として使用できます。害虫の被害が比較的軽微な場合には、グリーン予防・管理手段の一つとして生物農薬が化学農薬に取って代わることができ、それによって環境汚染を軽減し、農業生態系を保護する効果を得ることができます。
さらに、この研究で使用された Polh (ポリヘドリン) 遺伝子は多面体タンパク質プロモーターの一種であり、それと P10 はバキュロウイルス発現ベクター システム (BEVS) で最も一般的に使用されるプロモーターであり、どちらも後期段階で高度に発現されます。ウイルス感染症の[13]。ただし、p10 プロモーターの活性は polh プロモーターの活性よりも低いため、外来タンパク質の発現には polh プロモーターがよく使用されます。遺伝子 lef-8 はウイルス自身の RNA ポリメラーゼの最大のサブユニットをコードすることができ、後期発現因子の一種です[14]。lef-9 は、バキュロウイルスの lef-4、lef-8、および p47 とタンパク質複合体サブユニットを共コードする後期発現因子の一種です。研究の結果、lef-9遺伝子を欠くウイルスは感染活性を持つウイルス粒子を生成できないが、lef-9遺伝子を持つウイルスはウイルスの感染活性を回復させることで感染力を回復できることがわかった。したがって、lef-9 遺伝子はバキュロウイルスが感染力を持つ BV (出芽ウイルス) を形成するために必須の遺伝子です。[15]。lef-8 および lef-9 遺伝子は、さまざまな種類の核多角体病ウイルスにおいて高い保存性を持っていることがわかり、lef-8 および lef-9 遺伝子はウイルスの種類を識別するための基礎として使用できます。そこで、本研究ではpolh、lef-8、lef-9を検出対象とし、遺伝子配列のアラインメントを行ったところ、いずれも100%に達する高い相同性を示した。迅速分子検出法により、AcMNPV がヨトウガヨトウガに対して良好な殺虫活性を有することが再度検証され、ヨトウガヨトウの予防および制御におけるさらなる促進および応用に適している。
2019年以来、ヨトウガ（Spodoptera fragiperda）が中国に侵入し、トウモロコシの重要な害虫となっている。中国南部および南西部の一部地域に定住人口を形成しており、中国のトウモロコシ産業に多大な損失を与え、中国の食糧安全保障を深刻に脅かしている。[16]。現在の中国におけるヨトウガの予防と管理の厳しい状況に直面し、ヨトウガの予防と管理に効果的な殺虫剤のスクリーニングと開発を加速することが急務となっている。[17]。ウイルス性殺虫剤は、作用速度が遅く、殺虫スペクトルが狭いため、その広範な用途は限られていますが、生態学や環境保護への注目が高まる中、バキュロウイルス系殺虫剤は、バキュロウイルス殺虫剤に比べて大きな利点があるため、農業生産においてますます広く使用されることが予想されています。伝統的な農薬。昆虫ウイルス製剤は高温、日光、雨、害虫の年齢などの外部条件に影響されやすいため[18]。したがって、害虫の幼虫の発生がピークとなる時期に殺虫剤を散布することが推奨されます。ウイルス製剤がより効果的に役割を果たし、害虫の防除効果を高めるため、高温や光などの悪環境条件の影響を避けるため、晴れた日の午後4時〜5時以降に使用するのが最適です。 。